我们于2001年5月份，在浙江的北部山区一个朝北的山坡上发现了黑柄炭角菌的子实体，数量有20多个，有单枝的也有分枝为鹿角形的子实体〔子实体经干燥后制成标本〕，我们确定了蚁巢位置后于当年的12月份开始在二个区域内挖掘，下挖1.5米后，虽然找到三条蚁道和多个卫星巢但均没有发现白蚁废巢和黑柄炭角菌，通过蚁道中存活的白蚁观察确定，确认该蚁巢是黑翅土白蚁蚁巢。后来我们通过绘图测量，基本确定了该区域蚁巢的分布和主巢的位置，并于2002年3月份和2003年10月份分别在同一个山坡上的地下2米处挖到了一个直径37公分有3-4年巢龄的白蚁废巢和2个活巢，该废蚁巢上长有黑柄炭角菌菌核，最后我们选用了该废巢上生长的子实体、菌索用于分离纯化并得到的斜面菌种。

1. 3菌种的分离纯化

将接种实验用的黑柄炭角菌菌索用无菌水冲洗数次，再用70%的酒精表面灭菌，用刀片将其切成3mm大小的块状体，接种于改良 PDA斜面培养基上面，于25℃下培养星期左右，即可以获得菌丝体。然后，分别进行不同的温度、PH值以及营养条件等因子对其生长影响的实验。液体培养方法及其条件，斜面菌种接种量，每瓶接种0.25cm2菌种；液体接种量为5%，培养温度25℃-26℃。装液量：250ml三角瓶装100ml培养液，500ml装200ml，2500ml装1200ml,每组重复3次。

见图一：分离纯化的菌种

2：黑柄炭角菌的菌种鉴定

黑柄炭角菌的菌种由中国科学院微生物研究所检测鉴定，鉴定号：〔2003〕微检字第003号，菌株编号：22X-2001。

2.1黑柄炭角菌DNA提取与PCR扩增以及序列测定方法

2.2 DNA提取方法：SDS苯酚--氯仿法

2.3扩增程序：94℃5min;94℃ 1 min;52℃ 40’’;72℃ 50’’;2 Rep 34; 72℃ 10 min;

加样（25ul系统）：ddH2O 17.75ul 10×buffer 2.5ul 10mmdNTP 0.5ul 25mmMgCl2 1.5ul 10Pmol/ul ITS4 1ul (GGAAGTAAAAGTCGTAAGG) 10Pmol/ul ITS5 1ul(TCCTCCGCTTATTGATATGC) Tag酶 0.25ul DNA模板 1ul

2.4 PCR产物检测：1%琼脂糖、50V电压电泳30 min.

2.5测序：采用3730测序仪测序,我们完成了黑柄炭角菌菌种的基因测序。

3：分析与结论

我们经过了三年的跟踪观察和挖掘到的黑翅土白蚁主巢、卫星巢上生长的黑柄炭角菌菌核、子实体，通过纯化分离得到的菌种，在对菌种的多次固体复裁培养均能还原成相同的菌索、子实体和菌核，通过仿生态培养的菌丝体，经过DNA对比分析，证明黑柄炭角菌子实体、菌索和液体培养的菌球的ITS序列完全一致，确定了液体发酵培养的菌丝体和天然菌丝体的相附和还原性。

见图二：

1 2 3 4

1,2,3分别为炭角菌菌索、菌丝、液体培养的小菌球DNA的PCR扩增电泳图;

由此可以证明我们在湖州采集的新鲜乌灵参〔黑柄炭角菌〕纯化分离的菌种是黑柄炭角菌。

4：黑柄炭角菌〔乌灵参〕的应用研究和市场前景